Estudio preliminar de Citocinas en suero de perros con Leishmaniasis visceral en una zona endémica Venezolana / Preliminary Study of Cytokines in Sera from Dogs with Visceral Leishmaniasis from a Venezuelan Endemic Area

Diversos estudios en modelos de ratones han demostrado que la inmunidad protectora frente a Leishmania es mediada por linfocitos T, células presentadoras de antígeno y citocinas. Sin embargo, pocos estudios se han realizado para evaluar citocinas en perros infectados en forma natural con Leishmania infantum/chagasi. El perro doméstico es el principal reservorio del parásito, en tal sentido, el objetivo de este trabajo fue determinar las citocinas en suero de 33 perros con Leishmaniasis Visceral Canina (LVC), provenientes del estado Nueva Esparta, Venezuela (foco endémico). Los perros fueron clasificados en sintomáticos o asintomáticos, de acuerdo al análisis de los signos clínicos de la enfermedad, coincidentes con los títulos de anticuerpos contra las kinesinas recombinantes de Leishmania rK39 y rK26. Otros dos grupos incluyeron: 10 perros de la misma zona endémica como grupo control endémico (CE) y 10 perros de la zona no endémica como control sano (CS). Las concentraciones (pg/mL) de las citocinas solubles IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-6, IL-4 e IL-2 se determinaron por citometría de flujo (Kit CBA Hu Th1/Th2, BD TM). Los resultados mostraron concentraciones estadísticamente mayores (p<0,05) de IFN-γ (69,93±7,46), IL-4 (7,51±2,68), TNF-α (3,86±1,46) e IL-2 (39,85±3,84) en el grupo de perros asintomáticos, con respecto a los perros sintomáticos (60,8±10,6; 5,28±0,80; 2,76±0,72 y 36,04±3,61, respectivamente) y los perros sanos (51±14; 4,65±0,2; 3,21±0,89 y 32,65±5,86, respectivamente). Los perros asintomáticos también presentaron mayor concentración de IL-6 (4,9±0,55) que los CS (4,02±0,64) (p<0,01). Estos resultados demuestran que los perros en estado asintomático exhiben mayor proporción de citocinas de activación celular y proinflamatorias. Los resultados señalan a la medición de citocinas séricas como reflejo del estado inmunológico de los caninos en futuros estudios orientados a vacunación o terapia.

Different experimental murine models have shown that protective immunity against Lesihmania depends upon T cells, cytokines, and antigen presenting cells. However, the role of cytokines in naturally-infected hosts like domestic dogs is controversial. Few studies have evaluated cytokines in dogs naturally-infected with Leishmania infantum/chagasi. Since the domestic dog is the main reservoir of the parasite, a study was conducted to determine cytokines in serum of 33 dogs with Canine Visceral Lesihmaniasis from endemic areas of the State of Nueva Esparta, Venezuela. Dogs were classified as symptomatic (SD) and asymptomatic (AD), according to the expression of three or more clinical signs and levels of  antibodies for rK39 and rK26. Ten non-infected, rK39 negative controls were included from an endemic area (EA) and ten dogs from a non-endemic area were used as healthy controls (HC). The following cytokines (pg/mL) were measured in serum by flow cytometry (CBA Hu Th1/Th 2, BD TM kit): IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-6, IL-4 and IL-2. Results show a higher  concentration (P<0.05) of  IFN-γ (69.93±7.46), IL-4 (7.51±2.68), TNF-α (3.86±1.46), and IL-2 (39.85±3.84) in AD when compared with SD (60.8±10.6; 5.28±0.80; 2.76± 0.72; and 36.04±3.61, respectively); and HC (51±14; 4.65±0.2; 3.21±0.89, and 32.65±5.86, respectively). The AD also showed higher levels (P<0.01) of IL-6 (4.9±0.55) compared with HC (4.02±0.64). Results show that AD exhibit a higher proportion of cellular activation and proinflammatory cytokines. Results indicate that measuring of serum cytokines could reflect the immunological status in dogs in future clinical trials oriented to either vaccination or therapy.

Herramientas no invasivas en Venezuela: comparación entre las pruebas inmunoserológicas DAT, rK26 y rK39 en el diagnóstico de leishmaniasis visceral / Non invasive diagnostic tools for visceral leishmaniasis: a comparison of the immunoserological tests DAT, rK26 and rK39

Introducción. La leishmaniasis visceral constituye un problema de salud pública en los países en donde es endémica por ser potencialmente letal, principalmente en niños. El diagnóstico rápido es importante en el control de la enfermedad. Objetivo. Comparar las pruebas inmunocromatográficas rK39 (rK39 dipstick, Kalazar detect test, Inbios Internacional Inc.), ELISA rK26 y la prueba de aglutinación directa (Kit Biomedical Research) en relación con la prueba de ELISA rK39, como herramientas serodiagnósticas para la leishmaniasis visceral en Venezuela.Materiales y métodos. Se estudiaron 50 muestras séricas de pacientes positivos por la prueba ELISA rK39, provenientes de diferentes zonas endémicas: Nueva Esparta, Lara, Anzoátegui y Trujillo; se incluyeron 17 muestras de voluntarios sanos y 25 de pacientes con otras enfermedades. Se utilizó la prueba ELISA rK39 como método de referencia, considerándola como patrón de referencia imperfecto, a partir del cual se determinaron los valores de sensibilidad, especificidad, razón de verosimilitud y valores diagnóstico positivo y negativo en las demás pruebas evaluadas. Resultados. Todas las pruebas mostraron una fuerte correlación (p<0,0001) con la ELISA rK39. La aglutinación directa y la prueba inmunocromatográfica rK39 presentaron altos valores de sensibilidad, 89,74% (IC95% 81,34-98,15) y 94,15% (IC95% 87,65-100), respectivamente, y de especificidad, 81% (IC95% 79,96-99,51) y 100% (IC95% 100-100). La prueba ELISA rK26, a pesar de poseer buena especificidad, 99% (IC95% 95,17-100), tuvo baja sensibilidad, 37% (IC95% 23,41-50,15). Conclusión. Las pruebas de aglutinación directa y la prueba inmunocromatográfica rK39 presentaron los mayores valores de sensibilidad y especificidad. Ambas son simples, económicas y fácilmente aplicables. Por ello, son recomendables para efectuar un diagnóstico de leishmaniasis visceral eficaz y precoz en Venezuela.

Introduction. Human visceral leishmaniasis is a serious public health problem in endemic countries because of its high potential lethality, particularly in children. Rapid diagnosis is essential to early treatment and control of visceral leishmaniasis.Objective. The aim was to compare three serodiagnostic tools for human visceral leishmaniasis. Materials and methods. Three methods were compared: the rK39 dipstick (Kalazar detection test, Inbios International Inc.), ELISA rK26 and direct agglutination test (DAT) (KIT Biomedical Research). Fifty serum samples from patients positive for rK39 ELISA were compared from four endemic provinces in Venezuela: Nueva Esparta (Margarita island), Lara, Anzoátegui and Trujillo. Additional serum samples from 17 healthy volunteers and 25 patients with other diseases were included. The rK39 ELISA served as the baseline standard method. Sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and likelihood ratio were calculated for each test. Results. All methods had a positive correlation with rK39 ELISA (p<0.0001). They showed high sensitivity and specificity. The direct agglutination test and the rK39 dipstick showed high sensitivity values, 89.7% (95% CI: 81.34.0-98.2%) and 94.2% (95% CI: 87.7-100%), respectively, and high specificity, 81.0% (95% CI: 80.0-99.5%) and 100%. The rK26 ELISA showed good specificity, 99% (95% CI: 95.2-100%), but a very low sensitivity, 37% (95% CI: 23.4-50.2%). Conclusion. Overall results indicated that DAT and rK39 dipstick have the highest specificity and sensitivity. Both are simple, cost-effective and field applicable tests. Therefore, they are recommended for early and accurate diagnosis of visceral leishmaniasis.

Evaluación de una prueba de aglutinación directa como método alternativo para el diagnóstico de leishmaniasis visceral canina y humana en Venezuela / The direct agglutination test as an alternative method for the diagnosis of canine and human visceral leishmaniasis

Introduction. Visceral leishmaniasis is the most severe clinical form of leishmaniasis and is often fatal without proper treatment. Therefore, early and accurate diagnosis is important, but often difficult in endemic areas. Objective. The aim was to evaluate a direct agglutination test as a potential visceral leishmaniasis diagnostic method in endemic areas of Venezuela Materials and methods. The performance of the direct agglutination test, based on freezedried Leishmania donovani antigen was evaluated under laboratory conditions using serum samples of humans and dogs from several Venezuelan visceral leishmaniasis endemic areas: Nueva Esparta (Margarita Island), Lara, Anzoátegui and Trujillo Status. The study included confirmed visceral leishmaniasis patients (n=30), visceral leishmaniasis suspected subjects (n=4), healthy controls (n=19) and patients with other confirmed diseases (n=20). In addition, 24 serum samples from dogs with confirmed visceral leishmaniasis and 18 healthy control dogs were tested. Results. All serum samples of visceral leishmaniasis patients, either active or recovered, were positive. They showed anti- L. donovani titers above 1:1600. Three out of four suspected visceral leishmaniasis cases were also positive, while serum samples from endemic controls and patients with other diseases had titers lower than 1:800. A sensitivity of 100 percent was obtained for all threshold levels under consideration and 100 percent specificity at the threshold titer of 1:800 (95 percent confidence interval: 91-100 percent). A 93 percent sensitivity (95 percent confidence interval: 76-99 percent) was observed in dog samples, with 100 percent specificity (95 percent confidence interval: 79-100 percent) at the threshold titer of 1:200. Conclusion. The direct agglutination test seems suitable for use in epidemiological studies and for serological diagnosis of human visceral leishmaniasis and canine visceral leishmaniasis.

Introducción. La leishmaniasis visceral es la forma clínica más grave de la leishmaniasis. Ésta puede ser fatal si no se administra el tratamiento adecuado. Por ello, el diagnostico temprano es importante, pero a menudo difícil, en las áreas endémicas. Objetivo. Evaluar el potencial de la prueba de aglutinación directa como un método para el diagnóstico de leishmaniasis visceral en zonas endémicas de Venezuela. Materiales y métodos. La efectividad de la prueba de aglutinación directa con el antígeno congelación-descongelación de Leishmania donovani fue evaluada bajo condiciones de laboratorio usando muestras de sueros de humanos y perros provenientes de diferentes regiones endémicas de leishmaniasis visceral de Venezuela: Nueva Esparta (Isla de Margarita), Estados Lara, Anzoátegui y Trujillo. Se incluyeron pacientes con diagnóstico confirmado de leishmaniasis visceral (n=30), sospecha de leishmaniasis visceral (n=4), voluntarios sanos (n=19) y pacientes con otras enfermedades (n=20). Además, se evaluaron 24 muestras de suero de perros con leishmaniasis visceral y 18 controles. Resultados. Todas las muestras de los pacientes con leishmaniasis visceral activa o curada fueron positivas. Mostraron títulos anti-L. donovani por encima de 1:1.600. Tres de cuatro casos con sospecha de leishmaniasis visceral también resultaron positivos a la prueba, mientras que los sueros controles y los de los pacientes con otras patologías dieron títulos por debajo de 1:800. Se obtuvo una sensibilidad de 100% a todos los puntos de corte considerados y una especificidad de 100% al punto de corte de 1:800 (intervalo de confianza de 95%, IC95%: 90,97%-100%). Las muestras de perros mostraron una sensibilidad de 92,59% (IC95%: 75,69%- 99,09%) y 100% de especificidad (IC95%: 79,42%-100%) al punto de corte de 1:200. Conclusión. En general, nuestros resultados indican que el uso de la prueba de aglutinación directa es apropiado para la realización de estudios epidemiológicos y para el...

Therapy of Venezuelan patients with severe mucocutaneous or early lesions of diffuse cutaneous leishmaniasis with a vaccine containing pasteurized Leishmania promastigotes and bacillus Calmette-Guerin: preliminary report

Severe mucocutaneous (MCL) and diffuse (DCL) forms of American cutaneous leishmaniasis (ACL) are infrequent in Venezuela. Chemotherapy produces only transitory remission in DCL, and occasional treatment failures are observed in MCL. We have evaluated therapy with an experimental vaccine in patients with severe leishmaniasis. Four patients with MCL and 3 with early DCL were treated with monthly intradermal injections of a vaccine containing promastigotes of Leishmania (Viannia) braziliensis killed by pasteurization and viable Bacillus Calmette- Guerin. Clinical and immunological responses were evaluated. Integrity of protein constituents in extracts of pasteurized promastigotes was evaluated by gel electrophoresis. Complete remission of lesions occurred after 5-9 injections in patients with MCL or 7-10 injections in patients with early DCL. DCL patients developed positive skin reactions, average size 18.7 mm. All have been free of active lesions for at least 10 months. Adverse effects of the vaccine were limited to local reactivity to BCG at the injection sites and fever in 2 patients. Extracts of pasteurized and fresh promastigotes did not reveal differences in the integrity of protein components detectable by gel electrophoresis. Immunotherapy with this modified vaccine offers an effective, safe option for the treatment of patients who do not respond to immunotherapy with vaccine containing autoclaved parasites or to chemotherapy.

Programa control de la leishmaniasis visceral en Venezuela / Program control of the leishmaniasis visceral in Venezuela

La Leishmaniasis visceral (LV), o Kala-azar, es una enfermedad infecciosa parasitaria, potencialmente mortal, con amplia distribución geográfica tanto en el viejo como en el nuevo mundo. Su permanencia es asegurada por la existencia de una cadena epidemiológica constituida por fuentes de infección, agentes transmisores y hospedadores susceptibles. La leishmaniasis visceral es conocida en la India desde el siglo XIX, pero fue Leishman (1903) quien describió La Leishmania en muestras de bazo tomadas a un soldado irlandés proveniente de la India, identificándolas como formas degeneradas de Trypanosoma. También Donovan (1903) describe tres casos de fiebre negra o Kala-azar provenientes de la India, donde observó flagelos que no se parecían a los tripanosomas descritos por Leishman. En América, la LV fue descrita por primera vez por Migone (1913), en la Asunción, Paraguay, en un paciente de Mato Grosso, Brasil. Cunha y Chagas (1973) proponen el nombre de Leishmania Chagasi el agente causal de la LV en este continente. En Venezuela Martínez y Pons (1941) dieron a conocer el primer caso autóctono procedente de las Mercedes, estado Guárico, y años después, en 1970, Torrealba publica su tesis doctoral donde describe un total de 174 casos registrados en el país en el período de 1941-1969m distribuidos en los estados Zulia, Guárico, Cojedes, Carabobo, Aragua, Trujillo, Lara, Falcón, Portugesa, Distrito Federal, Anzoátegui, Monagas, Bolívar, Sucre y Nueva Esparta

Epidemiological aspects of human and canine visceral leishmaniasis in Venezuela

OBJECTIVE: To report recent data on the distribution of human and canine visceral leishmaniasis (VL) in Venezuela, and to highlight problems associated with effective control measures. METHODS: We report the number of cases, incidence rate, age and sex distribution, and mortality rates for human VL (HVL) for the period of 1995 through 2000, based on National Registry of Leishmaniasis data. We carried out serological studies on a total of 3 025 domestic dogs from the 12 states in Venezuela reporting cases of human VL in this 1995-2000 period and also from the state of Yaracuy, where cases were reported earlier during the decade of the 1990s. RESULTS: From 1995 through 2000, 242 cases of HVL were reported from 12 states, in various sections of Venezuela. There was a relatively stable national incidence rate of 0.2 cases per 100 000 persons per year. Of the 242 cases, 26.0 percent were from Margarita Island, one of the three islands that make up the state of Nueva Esparta (Margarita Island was the only one of the Nueva Esparta islands that had HVL cases). Over the 1995-2000 period, the annual incidence rates for Nueva Esparta ranged from 1.7 to 3.8 cases per 100000 population. Males in Venezuela were more frequently affected (59.5 percent) than were females (40.5 percent). In terms of age, 67.7 percent of the VL patients were < 4 years of age, and 80.6 percent were younger than 15 years. The mortality rate among the persons with VL was 7.85 percent during the 1995-2000 period. Serological screening with rK39 antigen of 1217 dogs from Margarita Island found a 28.5 percent positivity rate (testing of dogs was not done on the two other islands of Nueva Esparta). In contrast, the rate was 2.8 percent in the 1 808 samples from dogs from 12 states on the mainland. CONCLUSIONS: Human and canine VL are unevenly distributed in Venezuela. The distribution may reflect such factors as differences among the states in human population density, vector density, and the presence or absence of other trypanosomatidae. Particularly high infection rates in very young children as well as in domestic dogs occur in semiurban communities of Nueva Esparta, where other human-infecting trypanosomatidae have not been reported. Control measures related to limiting canine infection might contribute to disease control where VL infections are frequent. Reducing VL mortality requires increased awareness among medical professionals of the possibility of VL in the differential...

Dermatosis ampollar por IgA lineal de la infancia: reporte de un caso y revisión de la literatura / Ampuller dermatose by IgA lineal of the cildhood: report of a case and literature review

La dermatosis ampollar por IgA lineal es una enfermedad vesiculoampollar subepidérmica de etiología autoinmune que puede ser idiopática o también inducida por drogas. Clínicamente suele ser muy heterogénea pudiendo presentar características fenotípicas de epidermólisis ampollar adquirida, dermatitis herpetiforme, penfigoide ampollar y cicatricial. Se discute el caso de un preescolar de 6 años de edad en el cual se establece diagnóstico de dermatosis ampollar por IgA lineal por clínica, histopatológia e inmunofluorescencia, evolucionando satisfactoriamente con la administración combinada de metilprednisolona y dapsona

Epidemiological and immunological aspects of human visceral leishmaniasis on Margarita Island, Venezuela

Sixty-five patients were diagnosed with visceral leishmaniasis (VL) on Margarita Island in the decade from 1990 to1999; 86.2 percent were <= 3 years old. All were leishmanin-negative at diagnosis. Evaluation of 23 cured patients in 1999 revealed that 22/23 had converted to leishmanin-positive; five had persisting antibodies to rK39 antigen, with no clinical evidence of disease. Leishmanin tests were positive in 20.2 percent of 1,643 healthy individuals from 417 households in endemic areas. Of the positive reactors, 39.8 percent were identified in 35 (8.4 percent) of the households, 15 of which had an antecedent case of VL, a serologically positive dog or both. Weak serological activity to rK39 antigen was detected in 3 of 488 human sera from the endemic areas. The presence of micro-foci of intense peri-urban transmission and the apparent absence of other Trypanosomatidae causing human disease offer a unique opportunity for the study of reservoirs, alternative vectors and evaluation of control measures on the Island

Isolation of Leishmania infantum, zymodeme MON-1 from canine and human visceral leishmaniasis on Margarita Island, Venezuela

An increase in the incidence of human visceral leishmaniasis (HVL) has been detected in recent years on Margarita Island, located off the NE coast of Venezuela. Recent studies have revealed reactivity to rK39 antigen (Leishmania chagasi) in 20 percent of 541 sera from domestic dogs in endemic communities; PCR reactions were positive using primers for the L. donovani complex. Here we report that isolates from human and canine infection, identified by isoenzyme analysis, correspond to L. infantum, zymodeme MON-1. This appears to be the first isolation and identification of an isolate from HVL on Margarita Island and demonstrates the presence of this zymodeme in the canine population

Dermatosis por IG a lineal: presentación de un caso / Dermatoses by lineal IG: presentation of one case

Describimos el caso de una niña de 2 años de edad, natural y procedente de la localidad, quien presenta desde hace 2 meses, ampollas fláccidas sobre placas eritematosas localizadas a predominio de miembros inferiores y región glútea. El resultado histopatológico fue sugestivo, corroborándose con la inmunofluorescencia directa, el cual reportó banda lineal y continua de Ig A en la unión dermoepidérmica. Respondió con resolución completa al tratamiento con diaminodifenilsufona (DDS)

Desarrollo de inmunoterapia de la leishmaniasis cutánea americana en el Instituto de Biomedicina / The development of inmunotherapy of american cutaneous leishmaniasis at the Instituto de Biomedicina

El desarrollo de la inmunoterapia de la leishmaniasis cutánea americana en el Instituto de Biomedicina, fue un proceso complejo de más de dos décadas que involucró diversas disciplinas. Un aspecto importante fue la comparación de la leishmaniasis cutánea difusa con otras formas clínicas. Este estudio comparativo constituyó la base para proponer un espectro para la leishmaniasis cutánea americana, que se presentó en el Simposium CIBA 20 en 1974. Otra etapa importante fue el estudio de la prueba de competencia, respuesta macrofágica del enfermo de leishmaniasis cutánea difusa a la inyección intradérmica de una suspensión de promastigotes de cultivo de Lishmania. Comparando esta respuesta con la respuesta de estos mismos enfermos a la inyección intradérmica de bacilos de Calmette-Guerin pudimos demostrar que al mezclar ambos antígenos (promastigotes de Leishmania con bacilos de Calmette-Guerin) en una prueba intradérmica, se obtenía un nódulo de estructura tuberculoide con desaparición de los parásitos inoculados; esto sugirió una vacuna combinada para inmunoterapia de leishmaniasis. Esta vacuan fue estudiada en 217 pacientes con leishmaniasis cutánea localizada, en una experiencia doble ciego al azar, en el que se estudió comparativamente la inmunoterapia con quimioterapia, con meglumine antimoniato y con basilos de Calmette-Guerin solos. Los resultados demostraron que no había diferencias estadísticamente significativas entre el tratamiento con inmunoterapia o quimioterapia

Estudios de rosetas E y proliferación de linfocitos de sangre periférica en artritis reumatoidea / Studies of rosette e and proliferation in peripheral blood lymphocytes in patient with rheumatoid arthritis

En 11 pacientes con A.R. definida o clásica y 7 controles sanos se determinó porcentaje de Rosetas E y transformación de linfocitos de sangre periférica in vitro con el Mitógeno PHA. No se obtuvieron diferencias significativas en los valores promedio de porcentajes de Rosetas E, entre pacientes y controles. El valor promedio de los índices de estimulación linfocitaria con PHA (20 ug/ml) en pacientes con AR, fue inferior el valor promedio de índices en controles sanos y esta diferencia fue estadísticamente significativa (,0.05). Un defecto intrínseio de los linfocitos pudiera en parte explicar esta alteración

La tecnica de ensayo inmunoenzimatico (ELISA) en la evolución de micosis profunda / Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) in the evolution of deep mycoses

Este trabajo compara las pruebas de ELISA y de inmunoprecipitacion en el diagnostico y evolucion de las micosis profundas. Se estudiaron 16 pacientes de paracoccidioidomicosis y 9 de histoplasmosis con las tecnicas de inmunoprecipitacion y Elisa por un periodo de 6 a 24 meses. La prueba de ELISA se puede usar para evaluar la evolucion clinica de la paracoccidioidomicosis e histoplasmosis ya que nuestro resultados demuestran una buena correlacion entre la persistencia o desaparicion de anticuerpos circulantes y el cuadro del paciente